初级读本
核磁共振技术
核磁共振仪
核磁共振原理
根据量子力学原理，原子核与电子一样，也具有自旋角动量，其自旋角动量的具体数值由原子核的自旋量子数决定，实验结果显示，不同类型的原子核自旋量子数也不同：1、质子数和质子数均为偶数的原子核，自旋量子数为0。
2、质量数为奇数的原子核，自旋量子数为半整数。
3、质量数为偶数，质子数和中子数为奇数的原子核，自旋量子数为整数。由于原子核携带电荷，当原子核自旋时，会由自旋产生一个磁矩，这一磁矩的方向与原子核的自旋方向相同，大小与原子核的自旋角动量成正比。将原子核置于外加磁场中，若原子核磁矩与外加磁场方向不同，则原子核磁矩会绕外磁场方向旋转，这一现象类似陀螺在旋转过程中转动轴的摆动，称为进动。进动具有能量也具有一定的频率。原子核进动的频率由外加磁场的强度和原子核本身的性质决定，也就是说，对于某一特定原子，在一定强度的外加磁场中，其原子核自旋进动的频率是固定不变的。
原子核发生进动的能量与磁场、原子核磁矩、以及磁矩与磁场的夹角相关，根据量子力学原理，原子核磁矩与外加磁场之间的夹角并不是连续分布的，而是由原子核的磁量子数决定的，原子核磁矩的方向只能在这些磁量子数之间跳跃，而不能平滑的变化，这样就形成了一系列的能级。当原子核在外加磁场中接受其他来源的能量输入后，就会发生能级跃迁，也就是原子核磁矩与外加磁场的夹角会发生变化。这种能级跃迁是获取核磁共振信号的基础。为了让原子核自旋的进动发生能级跃迁，需要为原子核提供跃迁所需要的能量，这一能量通常是通过外加射频场来提供的。根据物理学原理当外加射频场的频率与原子核自旋进动的频率相同的时候，射频场的能量才能够有效地被原子核吸收，为能级跃迁提供助力。因此某种特定的原子核，在给定的外加磁场中，只吸收某一特定频率射频场提供的能量，这样就形成了一个核磁共振信号。
NMR技术
对于孤立原子核而言，同一种原子核在同样强度的外磁场中，只对某一特定频率的射频场敏感。但是处于分子结构中的原子核，由于分子中电子云分布等因素的影响，实际感受到的外磁场强度往往会发生一定程度的变化，而且处于分子结构中不同位置的原子核，所感受到的外加磁场的强度也各不相同，这种分子中电子云对外加磁场强度的影响，会导致分子中不同位置原子核对不同频率的射频场敏感，从而导致核磁共振信号的差异，这种差异便是通过核磁共振解析分子结构的基础。原子核附近化学键和电子云的分布状况称为该原子核的化学环境，由于化学环境影响导致的核磁共振信号频率位置的变化称为该原子核的化学位移。
耦合常数是化学位移之外核磁共振谱提供的另一个重要信息，所谓耦合指的是临近原子核自旋角动量的相互影响，这种原子核自旋角动量的相互作用会改变原子核自旋在外磁场中进动的能级分布状况，造成能级的裂分，进而造成NMR谱图中的信号峰形状发生变化，通过解析这些峰形的变化，可以推测出分子结构中各原子之间的连接关系。
最后，信号强度是核磁共振谱的第三个重要信息，处于相同化学环境的原子核在核磁共振谱中会显示为同一个信号峰，通过解析信号峰的强度可以获知这些原子核的数量，从而为分子结构的解析提供重要信息。表征信号峰强度的是信号峰的曲线下面积积分，这一信息对于1H-NMR谱尤为重要，而对于常见的全去耦13C-NMR谱而言，由于峰强度和原子核数量的对应关系并不显著，因而峰强度并不非常重要。
代谢组常用的核磁共振谱主要集中于氢谱，这是由于能够产生核磁共振信号的1H原子在自然界丰度极高，由其产生的核磁共振信号很强，容易检测。
NMR谱图图示
植物色素色谱分离
1903年
俄国植物学家Mikhail Tswett最先提出
1903年，色谱技术由俄国植物学家Mikhail Tswett最先提出。他采用填充有固体CaCO3细颗粒的玻璃柱，将植物色素的提取物加于柱顶端，然后以溶剂淋洗，被分离的组份在柱中显示了不同的色带，他称之为色谱。(希腊语中“chroma”=color; “graphein”=write)。色谱过程是利用样品中各组分理、化性质的差异，各组分在流动相和固定相中反复多次重新分配，结果使混合物得到分离。 
色谱图示例
- 按流动相的物态
气相色谱法（gas chromatography, GC）
液相色谱法（liquid chromatography, LC） - 按固定相的物态
气固色谱（固定相为固定吸附剂）
气液色谱（固定相为涂在固体担体上的或毛细管壁上的液体）
液固色谱
液液色谱 - 按固定相使用的形式
柱色谱 纸色谱 薄层色谱 - 色谱分离过程的机制
分配色谱 吸附色谱 离子交换色谱
排阻色谱（凝胶色谱）
1.吸附色谱（adsorption chromatography）
原理：吸附色谱利用固定相对物质分子吸附能力的差异实现对混合物分离，吸附色谱的色谱过程是样本中物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
吸附剂：吸附剂的吸附力强弱，由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭>氧化铝>硅胶>氧化镁>碳酸钙>磷酸钙>石膏>纤维素>淀粉和糖。大多数吸附剂遇水即钝化，所以吸附色谱大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。
洗脱溶剂：洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸>水>甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>醚>氯仿>苯>四氯化碳和己烷。为了得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得更佳的分离效果。2.分配色谱（partition chromatography）
原理：分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。
常用的分配色谱：
正相分配色谱——流动相的极性弱于固定相的极性，极性弱的先被洗脱，极性强的后被洗脱
反相分配色谱——流动相的极性强于固定相的极性，极性强的先被洗脱，极性弱的后被洗脱3.离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC）
原理：离子交换色谱利用被分离组与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
应用：离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。4.凝胶色谱
原理：凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小，改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙大小，获得不同的分离效果。 
原理：吸附色谱利用固定相对物质分子吸附能力的差异实现对混合物分离，吸附色谱的色谱过程是样本中物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
吸附剂：吸附剂的吸附力强弱，由能否有效地接受或供给电子，或提供和接受活泼氢来决定。常用吸附剂的吸附力的强弱顺序为：活性炭>氧化铝>硅胶>氧化镁>碳酸钙>磷酸钙>石膏>纤维素>淀粉和糖。大多数吸附剂遇水即钝化，所以吸附色谱大多用于能溶于有机溶剂的有机化合物的分离，较少用于无机化合物。
洗脱溶剂：洗脱溶剂的解析能力的强弱顺序是：醋酸>水>甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>醚>氯仿>苯>四氯化碳和己烷。为了得到较好的分离效果，常用两种或数种不同强度的溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力的溶剂系统，以获得更佳的分离效果。2.分配色谱（partition chromatography）
原理：分配色谱利用固定相与流动相之间对待分离组分溶解度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段分布于色谱柱或者担体表面。分配色谱过程本质上是组分分子在固定相和流动相之间不断达到溶解平衡的过程。
常用的分配色谱：
正相分配色谱——流动相的极性弱于固定相的极性，极性弱的先被洗脱，极性强的后被洗脱
反相分配色谱——流动相的极性强于固定相的极性，极性强的先被洗脱，极性弱的后被洗脱3.离子交换色谱（ion exchange chromatography, IEC）
原理：离子交换色谱利用被分离组与固定相之间发生离子交换的能力差异来实现分离。离子交换色谱的固定相一般为离子交换树脂，树脂分子结构中存在许多可以电离的活性中心，待分离组分中的离子会与这些活性中心发生离子交换，形成离子交换平衡，从而在流动相与固定相之间形成分配。固定相的固有离子与待分离组分中的离子之间相互争夺固定相中的离子交换中心，并随着流动相的运动而运动，最终实现分离。
应用：离子交换色谱主要用来分离离子或可离解的化合物。它不仅广泛地应用于无机离子的分离，而且广泛地应用于有机和生物物质，如氨基酸、核酸、蛋白质等的分离。4.凝胶色谱
原理：凝胶色谱的原理比较特殊，类似于分子筛。待分离组分在进入凝胶色谱后，会依据分子量的不同，进入或者不进入固定相凝胶的孔隙中，不能进入凝胶孔隙的分子会很快随流动相洗脱，而进入凝胶孔隙的分子则需要更长时间的冲洗才能够流出固定相，从而实现了根据分子量差异对各组分的分离。调整固定相使用的凝胶的交联度可以调整凝胶孔隙的大小，改变流动相的溶剂组成会改变固定相凝胶的溶涨状态，进而改变孔隙大小，获得不同的分离效果。
凝胶色谱图
色谱峰图示
- 保留时间(tR)
进样后某组分在柱后出现浓度极大时的时间间隔某个组分进入色谱柱开始到色谱峰顶点的时间间隔
- 死时间(t0)
不被固定相吸附或溶解的组分的保留时间流动相流经色谱柱所需要的时间
- 调整保留时间(tR
')扣除死时间后的保留时间tR'tR-t0
- 保留体积(VR)
由进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大时,所需通过色谱柱的流动相的体积VR
tR•FC
(FC流速,mL/min)
- 死体积(V0)
由进样器至检测器的流路中未被固定相占据的空间V0
t0•FC
- 调整保留体积(VR
')是由保留扣除死体积后的体积VR'VR- V0
- 相对保留值(r1,2)
- 保留指数(Ix)：
- 标准
正态色谱流出曲线上两拐点距离的一半。正常峰，σ为0.607倍峰高处的峰宽。
- 半峰宽(W1/2)
峰高处一半的峰宽。W1/2＝2.355 σ
- 峰宽(W)
通过色谱峰两侧拐点作切线在基线上所截得的距离。
W＝4σ 或 W＝1.699 W1/2 - 分离度(Resolution, R)
同时反映色谱柱效能和选择性的一个综合指标，也称总分离效能指标或分辨率。R 越大，相邻组分分离越好。当R=1.5时，分离程度可达99.7%，因此R=1.5通常用作是否分开的判据。
1.基于热力学的塔板理论
塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱的柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。2.基于动力学的范第姆特方程
范第姆特方程（Van Deemter equation）是对塔板理论的修正，用于解释色谱峰扩张和柱效降低的原因。塔板理论从热力学出发，引入了一些并不符合实际情况的假设，Van Deemter方程则建立了一套经验方程来修正塔板理论的误差。
范第姆特方程将峰形的改变归结为理论塔板高度的变化，理论塔板高度的变化则源于若干原因，包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等。
由于色谱柱内固定相填充的不均匀性，同一个组分会沿着不同的路径通过色谱柱，从而造成峰的扩张和柱效的降低，这称作涡流扩散。
纵向扩散是由浓度梯度引起的，组分集中在色谱柱的某个区域会在浓度梯度的驱动下沿着径向发生扩散，使得峰形变宽，柱效下降。
传质阻抗本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中，组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程，这种过程称为传质过程，阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中，色谱柱的传质阻抗为零，则组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零，这导致色谱峰扩散，柱效下降。
在气相色谱中范第姆特方程形式为： 
其中H为理论塔板高度，A为涡流扩散系数，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗系数，μ为流动相流速。
在高效液相色谱中，由于流动相粘度远远高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小，可以忽略不计算，因而范第姆特方程的形式为： 
塔板理论是色谱学的基础理论，塔板理论将色谱柱看作一个分馏塔，待分离组分在分馏塔的塔板间移动，在每一个塔板内组分分子在固定相和流动相之间形成平衡，随着流动相的流动，组分分子不断从一个塔板移动到下一个塔板，并不断形成新的平衡。一个色谱柱的塔板数越多，则其分离效果就越好。理论塔板高度越低，在单位长度色谱柱中就有越高的塔板数，则分离效果就越好。决定理论塔板高度的因素有：固定相的材质、色谱柱的均匀程度、流动相的理化性质以及流动相的流速等。
塔板理论是基于热力学近似的理论，在真实的色谱柱中并不存在一片片相互隔离的塔板，也不能完全满足塔板理论的前提假设。如塔板理论认为物质组分能够迅速在流动相和固定相之间建立平衡，还认为物质组分在沿色谱柱前进时没有径向扩散，这些都是不符合色谱柱实际情况的，因此塔板理论虽然能很好地解释色谱峰的峰型、峰高，客观地评价色谱柱的柱效，却不能很好地解释与动力学过程相关的一些现象，如色谱峰峰型的变形、理论塔板数与流动相流速的关系等。2.基于动力学的范第姆特方程
范第姆特方程（Van Deemter equation）是对塔板理论的修正，用于解释色谱峰扩张和柱效降低的原因。塔板理论从热力学出发，引入了一些并不符合实际情况的假设，Van Deemter方程则建立了一套经验方程来修正塔板理论的误差。
范第姆特方程将峰形的改变归结为理论塔板高度的变化，理论塔板高度的变化则源于若干原因，包括涡流扩散、纵向扩散和传质阻抗等。
由于色谱柱内固定相填充的不均匀性，同一个组分会沿着不同的路径通过色谱柱，从而造成峰的扩张和柱效的降低，这称作涡流扩散。
纵向扩散是由浓度梯度引起的，组分集中在色谱柱的某个区域会在浓度梯度的驱动下沿着径向发生扩散，使得峰形变宽，柱效下降。
传质阻抗本质上是由达到分配平衡的速率带来的影响。实际体系中，组分分子在固定相和流动相之间达到平衡需要进行分子的吸附、脱附、溶解、扩散等过程，这种过程称为传质过程，阻碍这种过程的因素叫做传质阻抗。在理想状态中，色谱柱的传质阻抗为零，则组分分子流动相和固定相之间会迅速达到平衡。在实际体系中传质阻抗不为零，这导致色谱峰扩散，柱效下降。
在气相色谱中范第姆特方程形式为：
在高效液相色谱中，由于流动相粘度远远高于气相色谱，纵向扩散对峰型的影响很小，可以忽略不计算，因而范第姆特方程的形式为：
超高液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC）是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC（高效液相色法）的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。
超高效液相色谱法的原理与高效液相色谱法基本相同，所改变的地方有以下几点：
1)小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3.5 um，甚至1.7 um，这样的孔径更加利于物质分离；
2)超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大，故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵；
3)高速采样速度的灵敏检测器；
4)使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；
5)仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。
与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。不过由于实验过程中仪器内部压力过大，也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低，仪器的连接部位老化速度加快，包括单向阀等部位零件容易出现问题等。
1)小颗粒、高性能微粒固定相的出现。高效液相色谱的色谱柱，例如常见的十八烷基硅胶键合柱，它的粒径是5um，而超高效液相色谱的色谱柱，会达到3.5 um，甚至1.7 um，这样的孔径更加利于物质分离；
2)超高压输液泵的使用。由于使用的色谱柱粒径减小，使用时所产生的压力也自然成倍增大，故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵；
3)高速采样速度的灵敏检测器；
4)使用低扩散、低交叉污染自动进样器，配备了针内进样探头和压力辅助进样技术；
5)仪器整体系统优化设计。色谱工作站配备了多种软件平台，实现超高效液相分析方法与高效液相分析方法的自动转换。
与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍，它缩短了分析时间，同时减少了溶剂用量降低了分析成本。不过由于实验过程中仪器内部压力过大，也会产生相对应的问题。例如泵的使用寿命会相对降低，仪器的连接部位老化速度加快，包括单向阀等部位零件容易出现问题等。
1、抗酸碱度干扰 2、分离效能高
3、灵敏度高 3、分析速度快
5、应用范围广泛 6、装置简单，操作方便 缺点：在缺乏标准样品的情况下，定性分析较困难。色谱是一种分离手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。为了达到这些目的，采用减小固定相颗粒大小，提高色谱分离的效率是最常使用的方法。但由于仪器谱带扩展的负面影响和系统压力范围的限制，减小颗粒大小的好处实际上无法完全实现。直到2004年，色谱设备和色谱柱技术上均取得了显著进步，能够使用较小颗粒[1.7-1.8μm]装填色谱柱，并实现其理论性能，当压力高达1030 Bar[15,000 psi]时，仍能精确输送流动相，使HPLC的分离度、分离速度和灵敏度显著提高。使用UPLC技术，现今已可以在做到高通量、超短分析时间的同时实现超高分离度。
3、灵敏度高 3、分析速度快
5、应用范围广泛 6、装置简单，操作方便 缺点：在缺乏标准样品的情况下，定性分析较困难。色谱是一种分离手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。为了达到这些目的，采用减小固定相颗粒大小，提高色谱分离的效率是最常使用的方法。但由于仪器谱带扩展的负面影响和系统压力范围的限制，减小颗粒大小的好处实际上无法完全实现。直到2004年，色谱设备和色谱柱技术上均取得了显著进步，能够使用较小颗粒[1.7-1.8μm]装填色谱柱，并实现其理论性能，当压力高达1030 Bar[15,000 psi]时，仍能精确输送流动相，使HPLC的分离度、分离速度和灵敏度显著提高。使用UPLC技术，现今已可以在做到高通量、超短分析时间的同时实现超高分离度。
质谱原理
质谱图图示
质谱流程
质谱流程图示
进样系统
四种方法
直接
注入
注入
气相
色谱
色谱
液相
色谱
色谱
气体
扩散
扩散
离子源
| 电离方式 | 适用化合物 | 进样形式 | 质量范围(DA) | 主要特点 |
| 电子轰击 （Electron impaction source, EI） |
小分子、低极性 易挥发 |
GC或液体 固体吸附于探针 |
1~1000 | 硬电离、重现性高 结构信息多 |
| 化学电离 （chemical ionization, CI） |
小分子、中低极性 易挥发 |
GC或液体 固体吸附于探针 |
60~1200 | 软电离、 提供[M+1]+ |
| 电喷雾离子化 （Electrospray ion source, ESI） |
小分子、蛋白质 多肽、难挥发 |
LC或直接注射 样本溶液 |
100~50000 | 软电离、多电荷 |
| 大气压力化学电离 （atmospheric pressure chemical ionization, APCI） |
小分子、中等极性 相对ESI有一定挥发性 |
试样溶于 粘稠基质中 |
＜1000 | 软电离、通常产生 [M+H]+或[M-H]- |
电子轰击(EI)示意图
注：1、样品送入加热管中；2、在加热管中溶剂挥发；3、加热管出口处放置电晕放电针, 使挥发出来的溶剂分子电离，形成等离子体；4、等离子体与样品分子反应，生成[M+H]+或[M-H]-准分子离子
大气压化学电离（APCI）示意图
大气压化学电离（APCI）示意图
注 1、形成带电液滴；2、液滴蒸发，液滴表面的场强增加；3、库伦爆炸，离子从液滴中脱离，在接口处聚焦质量分析器
| 质量分析器类型 | 特点 |
| 飞行时间质量分析器（TOF） | 结构简单、灵敏度高、质量范围宽，不同质荷比的例子必须同一时间，同初动能进入漂移管 |
| 四极杆质量分析器（Quadrupole Mass Analyzer） | 两个方向电场力作用，通过调节电场进行质量扫描或质量选择、 扫描速度快、操作相对简单、分辨率不高、杆体易被污染 |
| 离子阱（Ion trap） | 三个方向电场力作用，离子阱内离子做复杂运动，方便进行级联质谱测量、 能承受高压、价格相对低廉、体积小 |
| 离子回旋共振（ICR）质量分析器 | 具有很高的质量分辨率、能检测大质量离子、离子无损分析和多次测量， 具有很高的灵敏度和级联质谱能力 |
核磁共振技术
核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）是指具有自旋性质的原子核在核外磁场作用下，吸收射频辐射而产生能级跃迁的现象。1H-NMR代谢组技术检测生物样本中代谢物的H原子核的振动信号，根据不一样化学环境的H会在NMR谱图上出现不一样的信号实现定性，根据H原子个数与NMR谱图上相应的峰面积成正比实现定量。
单个物质1H NMR谱图示例
基于NMR的代谢组研究是利用生物体液、组织等的核磁共振谱图所提供的生物体内全部小分子代谢物的丰富信息，通过对这些信息的多元统计分析和模式识别处理，了解相关生物体在功能基因组学、病理生理学、药理药毒学等方面的状况及动态变化，以及它们所揭示的生物学意义，并希望从分子水平来认识生命运动的规律。2.NMR代谢组技术特点| 项目 | NMR特点 |
| 前处理方式 | 前处理简单，不需要做衍生化 |
| 检测方式 | 检测H原子核的振动 |
| 平台稳定性 （重现性） |
98%以上 |
| 灵敏度 | 10-6数量级 |
| 分析结果 | 通过比对标准数据库实现绝对定性， 峰下面积与浓度呈线性关系实现定量 |
| 适用范围 | 无偏向性，含氢水溶性小分子 （糖类、有机酸类、氨基酸类） |
Bruker AVANCE III HD 600MHz 配备CyroProb,提升5倍灵敏度最适合检测生物样本的设备配置。
气质联用技术
气质联用(Gas Chromatography and Mass Spectrometry，GC-MS) 即气相色谱和质谱联用技术， 待检测的样本一般需要进行衍生化处理，使样本中成分更容易气化，一般采用硬电离源（如：EI电离源），这种电离方式可以产生更多的碎片信息，可以通过比对商用数据库 （NIST、Wiley、Fiehn） 实现定性， 由于气质设备存在稳定性、 离子化效率及杂质影响问题，比对结果具有一定假阳性，需要用标准品验证实现绝对定性定量。
常见GC-MS的TIC谱图图示
基于GC-MS的代谢组分析技术适合检测样本中易挥发、易衍生化的代谢物，如：花朵中芳香物质、病人呼出的气体、脂肪酸类物质等。2.GC-MS代谢组技术特点| 项目 | GC-MS特点 |
| 前处理方式 | 需要做衍生化处理使样本 易气化和易电离 |
| 检测方式 | 硬电离破坏样本 |
| 平台稳定性 （重现性） |
85%-90% |
| 灵敏度 | 10-9数量级 |
| 分析结果 | 通过对商用数据库比对得到相对定性结 果绝对定性定量需要另购标准品验证 |
| 适用范围 | 适合检测易挥发、易衍生化、热稳定且 不易降解的物质，常用于脂肪酸的检测 |
| 仪器类型 | 特点 |
| GC-Quatropole | 四极杆质谱检测器结构简单易于维护 市场占有率高 |
| GC-TOF | 分高通量及高分辨率型号 超高速的质谱扫描 |
| GC/GC-TOF | 二维气质提供更好的色谱分离 配合高速质谱具备分析复杂混合物的能力 |
| GC-QQQ | 市场占有率少 定量准确 |
液质联用技术
液质联用 (Liquid Chromatography and Mass Spectrometry，LC-MS) 即液相色谱和质谱联用技术，代谢组样本一般不需要进行衍生化前处理， 一般采用软电离源（大气压化学电离APCI或电喷雾电离ESI），这种电离方式只产生分子离子信息，可以得到代谢物的分子量信息， 可以通过比对标准品质谱图或搜索其他非标准谱库得到相对定性结果。 由于LC-MS没有商用标准数据库，无法避免假阳性结果出现的可能性， 可以通过二级质谱进一步定性及使用标准品实现绝对定性定量。
LC-MS二级质谱辅助定性
基于LC-MS的代谢组分析技术适合检测样本中极性强、难挥发、易电离的代谢物，如：甘油三酯、甘油磷脂、植物激素等。2.LC-MS代谢组技术特点| 项目 | LC-MS特点 |
| 前处理方式 | 代谢组样本一般不需要做衍生化处理 |
| 检测方式 | 软电离得到分子质量信息 |
| 平台稳定性 （重现性） |
85%-90% |
| 灵敏度 | 10-9数量级 |
| 分析结果 | 通过比对标准品质谱图或搜索其他非标准 谱库得到相对定性结果，存在基质干扰， 可以选择高分辨质谱仪器，精准质量数有 利于对库分析是减少无效结果的输出 |
| 适用范围 | 适合检测易挥发、易衍生化、热稳定且 不易降解的物质，常用于脂肪酸的检测 |
| 仪器类型 | 特点 |
| UPLC-QQQ/Qtrap | MRM扫描模式， 为准确定量提供可靠方法 |
| UPLC-Q-TOF | 提供精准分子量（通常可精确到小数 点后第4位），为定性提供更可靠依据 |
1H-NMR代谢组数据分析
GC-MS代谢组数据分析
LC-MS代谢组数据分析
1.分段积分法
1.1什么是分段积分
所谓分段积分，就是把核磁谱图划分成若干等份，分别对每个等份进行积分，然后把所得的积分值作为统计学分析的变量。分段积分作为传统代谢组核磁共振图谱分析法拥有最大程度上简化图谱，使后期分析更加快速、简便的优点。它还可以一定程度上实现自动化分析功能，降低大批量样本分析对分析人员的要求。1.2.分段积分法面临的难题
1） 对酸碱度敏感
分段积分在分析生物样本时存在一个较难解决的问题：对酸碱度变化造成的化学位移偏差适应性不理想。
代谢组样本一般都来自生物体液,而生物体液在特定时期、状态下具有其特定的离子浓度和酸碱度。随着离子浓度和酸碱度的改变，核磁信号的化学位移、峰形等参数会发生变化。过于程式化的分段积分方法在分析过程中会出现偏差。
下面的图就是一个比较好的例子。图里面的四个图谱是同一个样本在不同酸碱度环境下面的表现。我们可以看出，淡蓝色的积分结果在一些区域产生了很大的偏差。（如图13中的分段号: 10，14等）这些差别不是因为样本的实际差别，而是分段积分造成的假象。如果选用分段积分方法，对类似数据的复查是很必要的。研究人员针对这个问题也提出了一些不一样的调整，但是大多数是属于基于一个固定的数学模型的“自适应”分段积分方法。这种“自适应”分段积分可以根据数据的特点，“自动”的调节分段积分的大小或（和）位置。这种方法往往需要针对具体的数据进行调整，而对于有些受酸碱度影响很大的样本也无能为力。 
分段积分法可以最大程度的简化数据，但这却是以牺牲数据分辨率为代价的。以一个简单的分段积分实验为例：
一般的一维氢谱拥有32000个点（0 ppm-12 ppm），如果我们采用0.04ppm的分段窗口可以得到300个分段。相对于我们32000个点的原始数据，分段积分方法带来了106倍的分辨率降低。那这样的分辨率降低会给我们的分析带来什么影响呢？在对比分析两种不同图谱时，我们经常会碰到以下类似的情况：情况一有一个分段里面一种代谢物积分值下降了20%，而另一种代谢物积分值上升了20%，结果是这个分段的积分值很有可能没有变化，分析人员很容易就忽略掉了这一点。情况二在一个分段里面包含了多种代谢物（这种情况其实很常见），总体积分值有变化，但是不知道对于各个代谢物的影响是什么。3） 难以实现定性定量
在对分段积分的处理结果进行后期统计学数据分析时，只能看到哪些积分段对各个分组之间的区分做出了贡献，表示我们应该对这些特定积分段着重关注。然而在对这些特定积分段做二次分析以获得其定性信息时，则只能依靠于对过往发表文献的查找与比对，再去推断这里最可能出现的是什么物质，所以难以实现绝对定性，绝对定量则更加困难；
除此之外，对于那些特定积分段所呈现的显著性差异到底是因为酸碱度引起的假象还是真实信号的改变，即使是真实信号所导致，那这些真实信号又是由哪些代谢物所产生、这些变化有什么样的生物学意义等问题，分段积分法难以提供足够的信息。
1.1什么是分段积分
所谓分段积分，就是把核磁谱图划分成若干等份，分别对每个等份进行积分，然后把所得的积分值作为统计学分析的变量。分段积分作为传统代谢组核磁共振图谱分析法拥有最大程度上简化图谱，使后期分析更加快速、简便的优点。它还可以一定程度上实现自动化分析功能，降低大批量样本分析对分析人员的要求。1.2.分段积分法面临的难题
1） 对酸碱度敏感
分段积分在分析生物样本时存在一个较难解决的问题：对酸碱度变化造成的化学位移偏差适应性不理想。
代谢组样本一般都来自生物体液,而生物体液在特定时期、状态下具有其特定的离子浓度和酸碱度。随着离子浓度和酸碱度的改变，核磁信号的化学位移、峰形等参数会发生变化。过于程式化的分段积分方法在分析过程中会出现偏差。
下面的图就是一个比较好的例子。图里面的四个图谱是同一个样本在不同酸碱度环境下面的表现。我们可以看出，淡蓝色的积分结果在一些区域产生了很大的偏差。（如图13中的分段号: 10，14等）这些差别不是因为样本的实际差别，而是分段积分造成的假象。如果选用分段积分方法，对类似数据的复查是很必要的。研究人员针对这个问题也提出了一些不一样的调整，但是大多数是属于基于一个固定的数学模型的“自适应”分段积分方法。这种“自适应”分段积分可以根据数据的特点，“自动”的调节分段积分的大小或（和）位置。这种方法往往需要针对具体的数据进行调整，而对于有些受酸碱度影响很大的样本也无能为力。
分段积分法（示例图）
注：a、b、c、d四张谱图，把它分成若干段，蓝色即为峰面积，我们可以看到粉色区域的出峰位置和峰形还有峰下面积是不同的，但是实际上这是同一个样本在不同酸碱度下测出的核磁谱图，可见酸碱度对分段积分的影响。2） 低数据分辨率分段积分法可以最大程度的简化数据，但这却是以牺牲数据分辨率为代价的。以一个简单的分段积分实验为例：
一般的一维氢谱拥有32000个点（0 ppm-12 ppm），如果我们采用0.04ppm的分段窗口可以得到300个分段。相对于我们32000个点的原始数据，分段积分方法带来了106倍的分辨率降低。那这样的分辨率降低会给我们的分析带来什么影响呢？在对比分析两种不同图谱时，我们经常会碰到以下类似的情况：情况一有一个分段里面一种代谢物积分值下降了20%，而另一种代谢物积分值上升了20%，结果是这个分段的积分值很有可能没有变化，分析人员很容易就忽略掉了这一点。情况二在一个分段里面包含了多种代谢物（这种情况其实很常见），总体积分值有变化，但是不知道对于各个代谢物的影响是什么。3） 难以实现定性定量
在对分段积分的处理结果进行后期统计学数据分析时，只能看到哪些积分段对各个分组之间的区分做出了贡献，表示我们应该对这些特定积分段着重关注。然而在对这些特定积分段做二次分析以获得其定性信息时，则只能依靠于对过往发表文献的查找与比对，再去推断这里最可能出现的是什么物质，所以难以实现绝对定性，绝对定量则更加困难；
除此之外，对于那些特定积分段所呈现的显著性差异到底是因为酸碱度引起的假象还是真实信号的改变，即使是真实信号所导致，那这些真实信号又是由哪些代谢物所产生、这些变化有什么样的生物学意义等问题，分段积分法难以提供足够的信息。
2.“目标性分析法”
1.1什么是“目标性分析法”
“目标性分析法”是一种基于数据库比对，以去卷积算法分离重叠峰，并以真实代谢物为目标的分析方法。相比较而言，目标性分析法比分段积分慢，但是目标性分析法可以实现代谢物绝对定性定量。1.2.“目标性分析法”的特点
1） 抗酸碱度干扰
加拿大Chenomx公司花了将近七年的时间建立了一个代谢物数据库，数据库里包含了340多种代谢物的模型，包括了氨基酸、有机酸、胺类、糖类等等，每个模型都是在不同pH值和不同离子浓度条件下的真实样本采集得到，这使得酸碱度对分析结果的影响被控制到最低（如下图所示）。
对于一个信号峰发生重叠、受酸碱度影响的核磁代谢组样本，使用“目标性分析法”可根据样本谱图中核磁信号峰的化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等情况，将数据库中代谢物的模型和样本信号逐一匹配，从而确定谱图中的信号组成各自属于哪些代谢物，同时根据峰下面积获得各代谢物的绝对浓度，最终从每张核磁谱图中得到被测样本中含有的代谢物种类和浓度（如下图所示）。
与分段积分方法不同，“目标性分析法”处理后直接得到代谢物的名称和浓度值列表，因此统计学分析的结果可直接从载荷图中读出差异代谢物是什么，而不再需要根据载荷图中的信息反推回原始谱图去做二次分析，有效解决了因谱图信号重叠而造成信号归属不明的问题，这使代谢组的分析变得更加精确，结果讨论变得更加细致。3） “目标性分析法”相较于质谱技术的特色
与质谱技术相比，质谱技术拥有更高的灵敏度，非常适合于对超低含量代谢物的检测，例如激素、黄酮类物质等。但质谱技术在没有标准品的情况下，很难得到代谢物的绝对定性定量分析结果，而在代谢组学研究中，需要准确定性的物质往往有几十种之多，标准品的购买会相对比较麻烦。在实现对初生代谢产物的绝对定性定量研究，且需要高通量检测样本的情况下，基于目标性分析法技术的核磁代谢组方法无疑会是最好的选择。4） 为什么要使用“目标性分析法”
总体来讲，分段积分法是通过简化和分离复杂问题，为我们提供一个高层面整体样本的概况，由于它毕竟难以实现代谢物绝对定性定量，能够得到的数据并不是很丰富，所以并不很适合深层定性定量的分析。如果研究项目需要获得具体代谢物种类及其浓度信息，并需应对酸碱度和离子浓度变化对核磁信号的影响，“目标性分析法”会是更好的选择。
1.1什么是“目标性分析法”
“目标性分析法”是一种基于数据库比对，以去卷积算法分离重叠峰，并以真实代谢物为目标的分析方法。相比较而言，目标性分析法比分段积分慢，但是目标性分析法可以实现代谢物绝对定性定量。1.2.“目标性分析法”的特点
1） 抗酸碱度干扰
加拿大Chenomx公司花了将近七年的时间建立了一个代谢物数据库，数据库里包含了340多种代谢物的模型，包括了氨基酸、有机酸、胺类、糖类等等，每个模型都是在不同pH值和不同离子浓度条件下的真实样本采集得到，这使得酸碱度对分析结果的影响被控制到最低（如下图所示）。
目标性分析法对酸碱度影响的校正
2） 有效解决重叠峰问题对于一个信号峰发生重叠、受酸碱度影响的核磁代谢组样本，使用“目标性分析法”可根据样本谱图中核磁信号峰的化学位移、峰形、半峰宽、耦合裂分等情况，将数据库中代谢物的模型和样本信号逐一匹配，从而确定谱图中的信号组成各自属于哪些代谢物，同时根据峰下面积获得各代谢物的绝对浓度，最终从每张核磁谱图中得到被测样本中含有的代谢物种类和浓度（如下图所示）。
目标性分析法对重叠峰的解析图示
注：黑色线是原始谱图，彩色是不同物质的峰，红色是不同代谢物谱图的矢量叠加，我们可以根据化学位移、峰形等信息逐一比对找出代谢物，并根据峰下面积得出代谢物的浓度，我们可以看出红色线与黑色线基本重合，证明我们已经找到了峰里面包含的所有代谢物种类和浓度。与分段积分方法不同，“目标性分析法”处理后直接得到代谢物的名称和浓度值列表，因此统计学分析的结果可直接从载荷图中读出差异代谢物是什么，而不再需要根据载荷图中的信息反推回原始谱图去做二次分析，有效解决了因谱图信号重叠而造成信号归属不明的问题，这使代谢组的分析变得更加精确，结果讨论变得更加细致。3） “目标性分析法”相较于质谱技术的特色
与质谱技术相比，质谱技术拥有更高的灵敏度，非常适合于对超低含量代谢物的检测，例如激素、黄酮类物质等。但质谱技术在没有标准品的情况下，很难得到代谢物的绝对定性定量分析结果，而在代谢组学研究中，需要准确定性的物质往往有几十种之多，标准品的购买会相对比较麻烦。在实现对初生代谢产物的绝对定性定量研究，且需要高通量检测样本的情况下，基于目标性分析法技术的核磁代谢组方法无疑会是最好的选择。4） 为什么要使用“目标性分析法”
总体来讲，分段积分法是通过简化和分离复杂问题，为我们提供一个高层面整体样本的概况，由于它毕竟难以实现代谢物绝对定性定量，能够得到的数据并不是很丰富，所以并不很适合深层定性定量的分析。如果研究项目需要获得具体代谢物种类及其浓度信息，并需应对酸碱度和离子浓度变化对核磁信号的影响，“目标性分析法”会是更好的选择。
| 分段积分法 | 目标性分析法 | |
| 分类 | 传统方法 | 专利技术 |
| 难易度 | 操作简单、 批量处理、快速、 对分析人员要求不高 |
操作有技术性要求、 分析每一个样本、耗时长、 对分析人员要求高 |
| 准确性 | 相对定性定量 | 绝对定性定量 |
| 抗干扰性 | 酸碱度和不同离子浓度 影响分析结果准确性 |
可校正酸碱度和离子 浓度造成的影响， 有效解决重叠峰 影响，提供准确结果 |
| 描述 | 当时最好的方法 已普遍应用 |
已发表的专利新技术 认知度还不够 |